庞佳昱， 鲁艳杰，， 左彦珍， 张鑫宇， 靳顺康， 李玉红，
(1.承德医学院 病理教研室， 河北 067000；
2.承德医学院 肿瘤研究室， 河北 067000)
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是威胁人类健康的重大疾病之一。在中国，结直肠癌标化发病率和标化死亡率均高于全球水平，疾病不仅严重威胁国民的生命健康，还给家庭和社会带来沉重的经济负担[1]。临床上有一种常见现象，罹患恶性肿瘤的病人在得知病情后往往表现出焦虑、恐惧和抑郁等心理问题，甚至一蹶不振，身体每况日下。长期慢性的心理压力刺激机体所产生的应激反应即为慢性应激。越来越多的证据表明，慢性情绪压力源可能参与结直肠癌的发生[2]，甚至影响肿瘤的转移[5]。近年来，国内外有关慢性应激促进肿瘤进展的机制研究较少且不够深入，且缺乏慢性应激对免疫系统影响的相关研究。因此，针对慢性应激影响免疫系统的机制仍需进一步探索。
近年人们逐渐认识到，肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)是支持肿瘤生长和转移扩散不可或缺的体系[6]。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是影响结直肠肿瘤细胞浸润的主要成分。在募集到肿瘤部位的固有免疫和适应性免疫细胞中，巨噬细胞十分丰富，并且存在于肿瘤进展的各个阶段。巨噬细胞在癌症中具有抗肿瘤和促进肿瘤的双重功能。TAMs可分为M1和M2亚型，CD80是M1的生物标记，CD163是M2的生物标记[7]，CD163的升高提示巨噬细胞向M2极化[8-10]。
由于慢性应激状态可能参与影响结直肠癌的进展与转移，通过筛选数据库分析结果提示，CCL2-CCR2轴在结直肠癌进展中起关键作用。因此，在慢性应激诱导结直肠癌恶性进展过程中，CCL2-CCR2信号通路在巨噬细胞极化中的作用有待进一步研究。本研究通过检测结直肠癌慢性应激患者与非应激患者肿瘤组织中CCL2与M1、M2巨噬细胞标记物的表达及其相关性，探讨CCL2与M2型巨噬细胞极化在慢性应激影响结直肠癌中的作用和机制。从免疫微环境角度寻找慢性应激影响结直肠进展的关键作用环节，为结直肠癌的诊疗及预后提供关键靶点和治疗新思路。
1.1 一般资料
选取2022年7月至2023年2月，于承德医学院附属医院胃肠外科进行结直肠癌手术患者的50例结直肠癌标本(男30例，女20例，年龄18～80岁)。其中应激患者25例，非应激患者25例。所有患者均于手术后病理证实为结直肠癌。所有患者初次入院通过肿瘤患者焦虑自评量表(SAS)[11]和抑郁自评量表(SDS)[12]住院的结直肠癌患者的慢性应激进行等级分类。本研究通过承德医学院伦理委员会审批(伦理审批受体编号：202215)。
1.2 主要仪器与试剂
兔抗人CCL2单克隆抗体(批号：00039244)购于武汉三鹰生物技术有限公司；
鼠抗人CD80单克隆抗体(批号：10033179)购于武汉三鹰生物技术有限公司；
兔抗人CD163单克隆抗体(批号：00123179)购于武汉三鹰生物技术有限公司；
鼠抗人GAPDH单克隆抗体(批号：AA54151)购于美国Earthox生物科技公司；
羊抗鼠单克隆抗体、羊抗兔单克隆抗体购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；
兔超敏二步法检测试剂盒(批号：2171D0817)购于中杉金桥生物技术有限公司；
DAB显色系统(批号：2010A1118)购于中杉金桥生物技术有限公司；
光学显微镜(OLYMPUS)。
1.3 患者慢性应激等级的分类
慢性应激的等级分类标准：根据William W.K. Zung编制的焦虑自评量表(SAS)评定焦虑状态，评定标准：标准分50分及以上为焦虑状态。根据William W.K.Zung编制的抑郁自评量表(SDS)评价抑郁状态，评定标准：标准分53分及以上为抑郁状态。无焦虑和抑郁状态的患者纳入非慢性应激组，存在焦虑和(或)抑郁状态的患者纳入慢性应激组。
1.4 免疫组织化学方法
采用免疫组织化学SP法检测CCL2、CD163蛋白在石蜡包埋病理切片标本的表达情况：石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸缓冲液梯度微波修复抗原，3% H2O2封闭20 min去除内源性过氧化物酶，滴加一抗兔抗人CCL2单克隆抗体(1∶100)，兔抗人CD163单克隆抗体(1∶1000)，阴性对照以PBS代替一抗。滴加二抗，PBS洗后DAB避光显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每例患者切片任意观察3个中倍视野(×200)，每个视野计算阳性细胞数总和后取均值。组化切片中的细胞按染色强度分级，并与背景着色对比，无着色为0分，淡黄色为1分，黄色或深黄色为2分；
阳性细胞计数：1%<1分≤25%，25 %<2分≤50%，50%<3分≤75%，阳性细胞计数>75%为4分。两者相乘之积，1～2分为阴性(-)，3～8分为阳性(+)。
1.5 CRCs组织中C80、CD163和CCL2 Western blot检测
取出液氮冻存组织15例，加入裂解液后，用超声破碎仪低温破碎10 min，离心取上清后，利用BCA定量测蛋白浓度，加热变性。SDS-聚丙烯凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭。加一抗(CCL2 1∶1000；
CD80 1∶2000；
CD163 1∶1000；
GAPDH 1∶5000)，放入4℃摇床过夜。TBST洗三次，加二抗，37℃孵育1 h，TBST洗三次，显色，应用Image J软件分析蛋白灰度值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析数据，计数资料以例数及率(%)表示，组间比较采用χ2检验；
相关性分析采用 Spearman 相关性检验，P<0.05认为具有统计学意义。
2.1 生信数据库结果显示CCL2或可通过巨噬细胞影响结直肠癌预后
通过从UCSC数据库中下载了经统一标准化的各类癌肿数据集：在结肠癌(T=275，N=349)和直肠癌(T=92，N=318)疾病模型中比较，CCL2在肿瘤组织中含量显著少于正常组织(图1A)；
Kaplan-Meier plotter数据库中，检测了CCL2与结直肠癌预后的相关性，发现CCL2高表达的患者预后差(P<0.05)(图1B)。同时，在TCGA数据库中进一步的提取了ENSG 00000108691(CCL2)基因在各个样本中的表达数据，筛选了样本来源为Primary Blood Derived Cancer - Peripheral Blood、Primary Tumor的样本，更进一步的对每一个表达值进行了log2(x+0.001)变换，最后剔除了单个癌种样本中个数小于3个的癌种，最终获得了26个癌种的表达数据。使用R软件(version 3.6.4)计算了每个肿瘤中基因在不同临床分期样本中的表达差异，使用非配对的Student’s t-Test进行两两之间的差异显著性分析，利用方差分析进行多组样本的差异检验，在结直肠肿瘤中观察到了显著差异COADREAD (T1=10，T2=57，T3=259，T4=50)(P<0.05)(图1D)。说明CCL2高表达与结直肠癌不良分期有关。
图1 生物信息学预测CCL2与结直肠癌分期、预后和免疫细胞浸润的相关性
那么，CCL2是如何影响结直肠癌患者的预后和临床分期的呢？在UCSC数据库中，根据基因表达重新评估了每个肿瘤中B cell、T cell CD4、T cell CD8、Neutrophil、Macrophage、DC浸润评分，发现CCL2高表达的结直肠癌组织中巨噬细胞浸润显著增高(图1C)。综上，提示CCL2或可通过调节巨噬细胞影响结直肠癌预后。
2.2 CCL2和M2型巨噬细胞标记物CD163在慢性应激结直肠癌患者组织中高表达
结合数据库的结果提示，CCL2影响结直肠癌患者预后。为了探究CCL2在慢性应激的结直肠癌患者中的表达情况。首先，本研究利用免疫组化方法检测了CCL2在慢性应激结直肠癌患者中的表达情况，发现与非应激组相比，应激组结直肠癌患者中CCL2显著高表达。(图2A)；
进一步在应激和非应激组织中进行M2型巨噬细胞标记物CD163的染色，发现与非应激组相比，应激组结直肠癌患者中CD163也显著高表达(图2B)。
图2 免疫组织化学检测CCL2、CD163表达情况(免疫组化SP法，DAB显色)
2.3 慢性应激结直肠癌患者中高表达的CCL2和M2型巨噬细胞标记物CD163存在正相关性
利用免疫组化方法，检测了CCL2、CD163在慢性应激结直肠癌患者中的表达情况后，发现与非应激组相比，应激组结直肠癌患者中CCL2、CD163均显著高表达，P<0.05，差异有统计学意义(图3)；
进一步比较应激和非应激组织中M2型巨噬细胞标记物CD163和CCL2的相关性，发现两指标呈正相关(r=0.8125 ，P<0.05)，差异有统计学意义。
图3 统计学分析免疫组织化学CCL2、CD163表达情况
2.4 慢性应激结直肠癌患者组织中CCL2与M1、M2型巨噬细胞极化标记物的表达情况
利用Western blot，检测了CD80、CD163、CCL2在慢性应激结直肠癌患者中的表达情况后，发现与非应激组相比，应激组结直肠癌患者中CCL2、CD163显著高表达，P<0.05，差异有统计学意义；
与应激组相比，非应激组结直肠癌患者中CD80显著高表达，P<0.05，差异有统计学意义如图4所示。
图4 Western blot检测CD80、CD163、CCL2表达情况及统计学分析
近年来，随着人们对心理学的认识和逐渐重视，发现存在焦虑抑郁状态的人群比例逐年增加，而随着生物-心理-社会医学模式的逐步完善，心理因素在肿瘤的发生、发展、治疗和预后中的作用日益受到关注。据报道，人类长时间的身体或心理压力会对许多身体外周器官的功能产生短暂或持久的影响，尤其是下消化道[13-17]。慢性应激可通过多方面途径影响胃肠功能甚至肿瘤的进展。实验研究证实，焦虑、抑郁等慢性应激可持续刺激应激相关激素(肾上腺素、去甲肾上腺素等)的释放[18]，课题组前期研究显示，这一现象会进一步加速肿瘤的生长、上调，侵袭相关基因的表达并增加血管生成等，从而促进肿瘤的恶性进展[19-22]。慢性应激现象在临床肿瘤患者中普遍存在，且伴有应激相关激素水平的显著升高。有研究表明，心理压力等应激使肾上腺激素增加会削弱免疫细胞执行抗癌的能力，阻碍免疫系统防御肿瘤的过程[23]，从而促进肿瘤干细胞特性并利于其生长和扩散[24]。
TAMs是肿瘤免疫微环境中极具吸引力的治疗靶标。基于多项结直肠癌单细胞转录本测序研究发现，TAMs是肿瘤微环境中浸润比例较高的免疫细胞亚型，且处在各细胞互作网络的核心环节，TAMs浸润较多预示着患者预后较差。TAMs主要通过3种机制促进癌症发展：①通过增强肿瘤血管生成潜在因子，并促进淋巴血管生成；
②重新编程肿瘤生长；
③肿瘤细胞侵袭、迁移和原发部位的内渗TAMs用于内皮细胞，进一步促进肿瘤的新生血管形成[25]。在肿瘤微环境中，浸润肿瘤实质的巨噬细胞具有M1表型和M2表型[26]。多项研究也证实，TAMs介导膜上高表达抗炎作用的M2巨噬细胞受体CD163，低表达抑炎作用的M1巨噬细胞标志物CD80 ，多趋向巨噬细胞极化为具有促瘤作用的M2型巨噬细胞。鉴于M2在肿瘤发展和转移中起促进作用，降低M2极化的比例可作为治疗肿瘤的一种方式[27]。另一方面，M1具有促进肿瘤免疫的抗肿瘤作用[28]。一些研究表明，慢性应激通过激活外周促肾上腺皮质激素释放激素信号传导的途径改变肠道功能[29]。结肠中经过修饰的免疫微环境可以通过增加细胞增殖、侵袭迁移能力或加速血管生成来诱导肿瘤的发生和发展。以上提示，慢性应激通过免疫功能影响结直肠癌进展值得深入研究。通过生物信息学筛查得知，巨噬细胞在结直肠癌患者中显著增高。本实验对50例患者进行应激与非应激分组，通过收集患者术后病理组织、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹实验均提示，巨噬细胞M2型标记物CD163在应激与非应激患者中显著差异。这一结果表明，在应激的结直肠肿瘤患者中，巨噬细胞更偏向M2方向极化，从而影响肿瘤发展。巨噬细胞的极化受肿瘤微环境的影响，表明巨噬细胞有能力成为肿瘤治疗的潜在靶点。
研究证实，细胞因子CCL2的分泌可动态调节肿瘤免疫微环境的重编程。有研究指出，当CCL2-CCR2轴被阻断时，TAMs在肿瘤中的积聚被消除[30-31]。阻断CCL2/CCR2轴可以阻止肿瘤细胞的生长[32]。因此，结直肠癌潜在有效治疗的方式之一是调控TAMs极化状态，阻止TAMs 向M2型极化，调控肿瘤免疫微环境。本研究证实，应激患者CCL2、M2型巨噬细胞标志物CD163表达显著升高，M1型巨噬细胞标志物CD80表达显著降低，且CCL2与CD163表达呈显著正相关。综上表明，慢性应激结直肠癌患者组织中，CCL2介导的M2巨噬细胞极化水平的升高，可能参与了慢性应激促进结直肠癌进展的过程，如图5所示。
图5 慢性应激结直肠癌患者CCL2影响巨噬细胞极化状态模式图
肿瘤免疫微环境的变化正逐渐成为当下研究者的关注热点，并成为探讨结直肠癌转移机制的重要焦点。本文重点围绕巨噬细胞作为分子信号网络的核心组成部分，探究慢性应激对结直肠癌免疫微环境的影响，这对结直肠癌的进展和预后有极为重要的影响。综上所述，针对CCL2的分泌机制和M2巨噬细胞极化作用机制，抑制CCL2分泌或抑制CCR2 活性，在改变巨噬细胞极化方向中显得尤为重要。所以CCL2可能是治疗结直肠癌患者的一个有前景的作用靶点。但本研究仍存在一定的局限性，未来需深入探究慢性应激通过何种机制影响CCL2的分泌以及CCL2对结直肠癌细胞功能学直接影响的相关问题。未来需从心身医学的新视角入手，希望通过靶向心理调节和免疫微环境调节的防治策略，为延缓CRC的进展提供理论依据。
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